S.E. Monsignor Ambrogio Spreafico, Vescovo di Anagni-Alatri, è nato a Garbagnate Monastero (Lecco) nella Arcidiocesi di Milano, il 26 marzo 1950 da Luigi e da Maria Molteni. Ha ricevuto la formazione al sacerdozio nei seminari della Congregazione dei Chierici Regolari di San Paolo (Barnabiti), dove ha percorso tutto il curriculum studiorum dalla scuola media fino al liceo classico. È stato ordinato Sacerdote il 12 aprile 1975. Si è incardinato successivamente nella diocesi di Roma. Ha ottenuto il baccalaureato in Filosofia e Teologia presso la Pontificia Università Urbaniana, proseguendo gli studi per la specializzazione in Sacra Scrittura presso il Pontificio Istituto Biblico di Roma, dove nel 1978 ha conseguito la Licenza e nel 1984 il Dottorato.
Ha ricoperto i seguenti incarichi: Docente di Antico Testamento presso l’ISSR della Pontificia Università Gregoriana dal 1978 al 1986; Docente di lingua ebraica al Pontificio Istituto Biblico di Roma (1978-1991); docente di lingua ebraica presso la facoltà Valdese di Teologia negli anni 1984-85; dal 1992 al 2008 Docente di Antico Testamento alla Facoltà Teologica della Pontificia Università Urbaniana; Rettore Magnifico della medesima Università per tre mandati (1997-2000; 2001-2003; 2005-2008); Presidente della Conferenza dei Rettori delle Università Pontificie Romane (2000 – 2003) e Consultore della Congregazione per l’Evangelizzazione dei Popoli dal 1998. È autore di numerose pubblicazioni ed articoli di carattere biblico e spirituale su diverse riviste e dizionari specializzati. Tra le lingue moderne conosce e parla tedesco, inglese e francese, legge  e comprende lo spagnolo e il portoghese.
Ha svolto la sua attività pastorale nella comunità di Sant’Egidio a Roma e in  Germania, e nella parrocchia di Santa Maria in Trastevere e di San Filippo Neri alla Garbatella in Roma. Il 10 aprile 1998 è stato nominato Cappellano di Sua Santità. È stato eletto vescovo coadiutore di Frosinone-Veroli-Ferentino il 3 luglio 2008 e consacrato Vescovo nella Arcibasilica Lateranense il 26 luglio 2008 dal card. Tarcisio Bertone, Segretario di Stato di Sua Santità. Il 28 luglio 2008 ha iniziato il suo ministero in Diocesi. Il 18 ottobre 2008, alla morte di Sua Eccellenza Mons. Boccaccio, è divenuto Vescovo della Diocesi. Presidente della Commissione Episcopale della Conferenza Episcopale Italiana per l’Evangelizzazione dei Popoli e la Cooperazione tra le Chiese dal maggio 2010 al giugno2015. Il 4 maggio 2011 è stato nominato dal Santo Padre membro della Congregazione delle Cause dei Santi. Dal gennaio 2016 è Presidente della Commissione Episcopale per l’ecumenismo e il dialogo. L’8 luglio 2020 è stato nominato dal Santo Padre membro del Pontificio Consiglio per il Dialogo Interreligioso. Dal 14 giugno 2021 è stato nominato Presidente della Commissione Regionale per l’Ecumenismo e il Dialogo Interreligioso (per il quinquennio 2021-2025). Dal 14 giugno 2021 è stato nominato Presidente della Commissione Regionale per l’Ecumenismo e il Dialogo Interreligioso (per il quinquennio 2021-2025).
In data 10 novembre 2022 il Santo Padre Francesco, lo ha nominato Vescovo della Diocesi di Anagni-Alatri, unendo le due sedi in persona Episcopi. Fa il suo ingresso solenne in Diocesi, il 15 gennaio 2022 ad Anagni, dove la domenica successiva, dopo la prima visita ad Alatri, accoglie Sua Santità Teodoro II, Papa e Patriarca di Alessandria d’Egitto e di tutta l’Africa, ospite dell’Accademia Bonifaciana per ricevere il Premio Internazionale Bonifacio VIII.
Il 18 febbraio 2023 è stato nominato dal Papa membro del Dicastero per la Cultura e l’Educazione.
È Grande Ufficiale dell’Ordine Equestre del Santo Sepolcro di Gerusalemme ed è Priore della delegazione locale, che comprende tutto il territorio delle sue due diocesi.
A seguito dell’art. 11 dello Statuto dell’Accademia Bonifaciana, emanato nel 2003, in quanto Vescovo di Anagni-Alatri, assume anche la Presidenza onoraria della stessa Istituzione, succedendo così a Monsignor Lorenzo Loppa, che la deteneva dallo stesso anno di fondazione fino al 2022.